摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗技術(shù)也在不斷發(fā)展前進(jìn)著。目前，應(yīng)用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、核酸分子雜交、基因芯片、多聚酶鏈反應(yīng)等，該文對這些檢測技術(shù)進(jìn)展做一綜述。

 

對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細(xì)菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、**、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、癡呆等**，也是危害食品**的主要因素之一。近年來出現(xiàn)的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等**的傳染性極強(qiáng)，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、準(zhǔn)確。常規(guī)病原學(xué)檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術(shù)水平要求比較高。隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，病原學(xué)診斷已不再局限于病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現(xiàn)并被應(yīng)用于臨床和實驗室 J。核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無污染、結(jié)果**，可以準(zhǔn)確靈敏地鑒定病原微生物。

1 傳統(tǒng)的病原微生物的檢測方法

傳統(tǒng)的病原微生物學(xué)實驗室檢查以染色、培養(yǎng)、生化鑒定等為主，將標(biāo)本直接涂片染色鏡檢和接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)是對細(xì)菌或**感染性**進(jìn)行病原學(xué)診斷的常用方法。

1．1 直接涂片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色后可借助顯微鏡觀察其大小、形態(tài)、排列等。直接涂片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態(tài)的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結(jié)核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接涂片鏡檢不需要特殊的儀器和設(shè)備，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。

1．2 分離培養(yǎng)與生化反應(yīng) 分離培養(yǎng)主要用于臨床標(biāo)本(如血液、痰、糞便等)或培養(yǎng)物中有多種細(xì)菌時對某一種細(xì)菌的分離。細(xì)菌的生長繁殖需要一定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。為解決這一問題，各種自動化培養(yǎng)和鑒定系統(tǒng)不斷產(chǎn)生，傳統(tǒng)鑒定方法也在逐步改進(jìn)，大大加快了檢驗速度。例如Microscan WalLCAway全自動微生物分析儀，可同時做細(xì)菌鑒定和藥敏試驗，檢驗500多個菌種。苛養(yǎng)菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養(yǎng)要求比較高，常規(guī)培養(yǎng)陽性率低。雍剛 等將不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養(yǎng)基中制成了新型淋病奈瑟菌培養(yǎng)基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養(yǎng)率。蘇盛通等在營養(yǎng)瓊脂中加人了中藥紅棗、赤小豆培養(yǎng)甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細(xì)菌，生長指數(shù)明顯高于血平板。

1．3 組織細(xì)胞培養(yǎng) 活組織細(xì)胞培養(yǎng)適于專營活組織細(xì)胞內(nèi)生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細(xì)胞是不一樣的，將活細(xì)胞從病原體敏感的動物組織中取出在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)或用病原體敏感細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，再將病原體接種于相應(yīng)的組織細(xì)胞中后，病原體可在其中繁殖增長，引起特異性的細(xì)胞病變效應(yīng)。也可以將病原體直接接種于敏感動物體內(nèi)，引起相應(yīng)組織器官出現(xiàn)特異的病理學(xué)改變。往往可以根據(jù)這些特異的病變對病原體進(jìn)行鑒定。

2 血清學(xué)與**學(xué)檢測

血清學(xué)檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進(jìn)行快速鑒定的技術(shù)，簡化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術(shù)、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術(shù)、協(xié)同凝集試驗、酶聯(lián)**測試技術(shù)等。酶聯(lián)**技術(shù)的應(yīng)用大大提高了血清學(xué)檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機(jī)體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國人群感染率高達(dá)50％ ～80％ ，應(yīng)用酶聯(lián)**吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結(jié)果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應(yīng)用于乙型肝炎病人早期血清學(xué)診斷的效果*為明顯。

臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細(xì)菌中分離出目標(biāo)菌是關(guān)鍵。**磁珠分離技術(shù)(IMBS)是

近年來發(fā)展起來的在微生物檢測領(lǐng)域中一種新技術(shù)。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯(lián)到磁珠微球上，通過抗原抗體反應(yīng)形成磁珠一目標(biāo)病原體復(fù)合物或磁珠一一抗一目標(biāo)病原體復(fù)合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標(biāo)病原體分離出來。目前已經(jīng)開發(fā)出了針對各種病原體的**磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色***、軍團(tuán)菌等，廣泛應(yīng)用到各級科研和實驗室 。經(jīng)IMBS分離出的白色***可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間縮短至4 h。IM—Bs還可以和其它檢測技術(shù)聯(lián)合來檢測病原菌，**磁珠分離得到的目標(biāo)菌可繼續(xù)用于分離培養(yǎng)使大腸埃希菌0157*低檢測限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)(IMBS—PCR)可對培養(yǎng)條件比較特殊的細(xì)菌如苛養(yǎng)菌、***進(jìn)行快速檢測，肉類中的產(chǎn)**型產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)IMBS．PCR檢測，檢測時間縮短到10 h，*低檢測限可達(dá)10cfu·g～，有研究者利用IMBS結(jié)合實時熒光定量PCR(IMBS—RT—PCR)成功檢測出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測時間大大縮短；Leon—Velarde等利用IMB8結(jié)合酶聯(lián)檢測，大大提高了沙門菌的檢測效率。

3 基因檢測

隨著科技水平發(fā)展，分子生物學(xué)檢測技術(shù)日新月異，對病原微生物的鑒定已不再局限于對普通外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特性等的一般檢驗上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別于其他種或?qū)?，檢測其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發(fā)展，基因檢測技術(shù)逐漸代替其它檢測技術(shù)，成為臨床檢驗科和基礎(chǔ)實驗室對病原體的主流檢測技術(shù)。

3．1

核酸雜交技術(shù)具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸雜交，其雜交雙方是所使用探針和要檢測的核酸。在病原微生物檢測中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細(xì)胞中分離出來，純化后在體外結(jié)合到一定的固相支持物上，與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。核酸原位雜交是指標(biāo)記的核酸探針直接與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交。探針還可以用熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置。核酸分子雜交檢測技術(shù)與其它方法相比顯著地優(yōu)點是簡便、敏感、快速、特異。Wong 等用熒光標(biāo)記2個不同的寡核苷酸探針從血液標(biāo)本中檢測出假單胞菌屬和不動桿菌屬的細(xì)菌，*低檢測限為10 cfu·mL～，特異度為100％ ，檢測時間不到2 h。寡核苷酸探針是針對病原體特異基因序列設(shè)計的，可以將待檢測的病原體定位在不同的分類等級，如科、屬、種、亞種“ 。（病原微生物檢測技術(shù)進(jìn)展）

3．2

 基因芯片技術(shù)基因芯片(DNA chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA芯片，是生物芯片的一種 j，是

核酸分子雜交技術(shù)發(fā)展延伸而來的。通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計甚至百萬計的基因探針即DNA片段有規(guī)律地排列成二維DNA探針陣列，固定到硅片、玻片等固態(tài)支持物上，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行核酸雜交，用于基因檢測工作。其測序原理與核酸雜交一樣，但解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)操作繁雜、檢測效率低、自動化程度不高的缺點?；蛐酒诓≡⑸锔腥驹\斷上的應(yīng)用，大大縮短了確診所需要的時間，而且能檢測出病原體是否耐藥、對那些***耐藥、對那些***敏感。Naas 等設(shè)計的基因芯片可以檢測出銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、鮑氏菌屬中各型B一內(nèi)酰胺酶類耐藥基因。蔡挺等設(shè)計的基因芯片檢測出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌對l7種**藥物的耐藥率。Batchelor 等開發(fā)的基因芯片可以檢測出編碼耐超廣譜8．內(nèi)酰胺酶、磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖甙類等47個耐藥基因的大腸埃希菌和沙門氏菌?；蛐酒夹g(shù)同樣還有些問題有待解決，如提高芯片的特異性和檢測信號的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多數(shù)芯片都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因芯片到目前主要局限于實驗室研究而未能廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物的檢測與鑒定。（病原微生物檢測技術(shù)進(jìn)展）

3．3 PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導(dǎo)未知片段中微量待測基因片段并進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。由于PCR可以對待測基因進(jìn)行擴(kuò)增，特別適用于病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強(qiáng)，可能會造成假陽性的出現(xiàn)。PCR技術(shù)在近20年里發(fā)展迅速，從基因擴(kuò)增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。Jbara 用PCR和傳統(tǒng)法直接檢測75例樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌，與傳統(tǒng)方法相比，PCR檢測的特異度和靈敏度分別為87．3％ 和100％ 。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，可同時擴(kuò)增出多個核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。多重PCR具有：(1)高效性，在同一反應(yīng)體系內(nèi)可同時檢出多種病原微生物，或?qū)ν徊≡⑸锏牟煌蛣e進(jìn)行分型；(2)系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如幾種肝炎病毒同時感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養(yǎng)的無芽胞***感染；破傷風(fēng)桿菌，炭疽桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰(zhàn)傷感染細(xì)菌感染；(3)經(jīng)濟(jì)簡便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時被檢出，節(jié)省試劑、節(jié)約費(fèi)用、節(jié)省時間，為臨床提供更快更多更準(zhǔn)確的診斷信息。Reyes等 用多重PCR從90例發(fā)熱但培養(yǎng)陰性的兒童細(xì)菌性腦膜炎腦脊液樣本中檢測出了腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，特異度100％ ，敏感度89％。實時熒光定量PCR，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR對性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預(yù)后評估等具有重要價值，為流行病學(xué)調(diào)查提供幫助 J。王娉等 建立了多重實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，同一體系能同時快速檢測出耐甲氧西林和產(chǎn)腸**A的金黃色葡萄球菌。熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性引物可準(zhǔn)確反映病原體感染和藥物療效，特別適用于不可人工培養(yǎng)和難以培養(yǎng)的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷?；蛐酒夹g(shù)與多重PCR結(jié)合可以通過PCR對目的基因進(jìn)行放大，通過基因芯片的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術(shù)的優(yōu)勢互補(bǔ)，已廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測。將病原體特異性基因作為靶基因設(shè)計出引物與探針，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，制備出寡核苷酸芯片，再對待測樣本靶基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與病原菌多重PCR基因芯片檢測體系雜交，可根據(jù)雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進(jìn)行檢測和鑒定。（病原微生物檢測技術(shù)進(jìn)展）

3．4 其它基因檢測技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，各種新的基因檢測手段不斷出現(xiàn)。Notomi等于2000年開發(fā)出一種新的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法(1oop—mediated isothermal amplifi—cation of DNA，簡稱LAMP)，針對靶基因序列上6或8個特異區(qū)域設(shè)計出4或6條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)和鏈置換對目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增。短短幾年LAMP已被廣泛應(yīng)用于**診斷、食品檢驗、環(huán)境監(jiān)測、生物**等各方面心 ]。李蒙等 運(yùn)用LAMP法60 min檢測了16例開放性傷口深部傷口感染分泌物中的破傷風(fēng)芽孢梭菌，其中陽性為4例，*低檢測限為4 x 10 。有研究報道l2 用LAMP技術(shù)快速檢測了200例肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)法和染色法。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multiple—locus Variable—nun—ber Tandem repeat Analysis，MLVA)是一種根據(jù)病原體基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的特征來對病原體基因分型的一種技術(shù)，廣泛應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定 ?。

4 小結(jié)與展望

對病原體進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學(xué)研究由宏觀領(lǐng)域向微觀領(lǐng)域的發(fā)展，病原體檢測方法也從組織形態(tài)學(xué)水平深入到分子水平、基因水平。近年來發(fā)展起來的病原微生物高通量檢測技術(shù)樣本需要量少、快速省時、無污染、診斷結(jié)果**、自動化程度高，相信隨著研究的不斷進(jìn)展和深入，這些高通量診斷技術(shù)和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測技術(shù)的聯(lián)合和綜合更是有著廣闊的應(yīng)用前景。（病原微生物檢測技術(shù)進(jìn)展）